3T3-L1脂肪细胞诱导分化方案

3T3-L1细胞系来源于小鼠胚胎成纤维细胞，具有快速分裂并向脂肪样细胞分化的独特特性。这一细胞系最早由Green和Kehinde于1974年分离，广泛应用于脂肪细胞分化、代谢研究，及肥胖和糖尿病等代谢性疾病的研究中。

为了评估诱导分化效果，通常采用多种检测方法。油红O染色是经典的评估脂肪细胞脂滴积累的方法，能够直观地反映细胞的脂肪化程度。油红O是一种脂溶性染料，能够特异性结合细胞内的中性脂质，形成红色脂滴。通过显微镜观察脂滴的生成，数量和大小的增加表明诱导分化成功。

此外，还可以通过检测分子标志物来判断诱导效果。例如，评估脂肪细胞特异性基因或蛋白的表达，如PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、aP2（脂肪细胞脂肪酸结合蛋白）、LPL（脂蛋白脂肪酶）等，或者使用Western Blot检测对应蛋白的表达水平。值得注意的是，诱导分化后3T3-L1细胞形态显著改变，细胞内出现大量脂滴，这一形态变化也是判断诱导成功的重要依据。

实验步骤

第一阶段：细胞培养

1. 将细胞以每平方厘米3×10³个的密度接种于六孔板中。

注意事项：

• 建议使用早代次的细胞进行实验，以确保良好的分化效果。
• 确保细胞铺板均匀，以避免分化不均匀和细胞漂浮。

2. 在DMEM高糖培养基中培养细胞，添加10%小牛血清或胎牛血清以促进增殖，直到达到70%的汇合度，每2-3天更换一次培养基。

3. 当细胞在37℃、5% CO₂环境中生长至接近90%汇合度时，可进行分化诱导。注意，分化前的汇合度应控制在70%以下以减少细胞死亡风险。

第二阶段：分化诱导培养基配制

培养基的制备需在无菌条件下进行。相关成分包括MDI诱导培养基（甲基异丁基黄嘌呤IBMX、地塞米松、胰岛素）和胰岛素应当新鲜制备。

1. 准备储备溶液：在DMSO中制备IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。如果使用冻干胰岛素，请根据说明书复溶。

2. 配制100mL的MDI诱导分化培养基，混合各成分以达到最终浓度。

第三阶段：分化诱导过程

1. 从培养箱取出细胞培养板，去除DMEM培养基，每孔添加2-3mL的MDI诱导培养基（记为第0天）。

注意事项：

• 添加诱导剂时，应轻柔操作，沿侧壁慢慢注入，减少对细胞的物理冲击。
• 诱导培养基应预热至37℃以降低对细胞的刺激。

2. 第3天，去除MDI诱导培养基，用2-3mL的胰岛素培养基替换。

3. 第6天，去除胰岛素培养基并添加新鲜的DMEM。

4. 通常在第7-10天左右，可以获得完全分化的脂肪样细胞。

5. 分化效果检测：可以通过油红O染色或监测脂肪细胞标志物（如FABP4和脂联素）的表达进行观察。

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