第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定基因表达

在不同样品中进行基因表达量的相对值测定时，选择合适的内参基因至关重要。选择内参基因时应遵循以下原则：

• (1) 选择表达稳定且丰丰的基因作为内参基因；
• (2) 避免盲目选用常用的内参基因；
• (3) 常见的内参基因包括GAPDH、Actin和Tublin。

内参基因的选择直接影响结果的有效性。引入内参基因后，可以进行准确的结果计算。

二、绝对定量

绝对定量是通过标准品来测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。标准品可以包括以下几类：

• A/ 克隆质粒；
• B/ PCR产物；
• C/ cDNA（注意：此方法用于扩增效率测定等用途，不适用于绝对定量）。

计算拷贝数时，需要平均分子量（MW）的信息：

• dsDNA = (碱基数) x (660 道尔顿/碱基)；
• ssDNA = (碱基数) x (330 道尔顿/碱基)；
• ssRNA = (碱基数) x (340 道尔顿/碱基)。

拷贝数计算公式为：

(602x10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml。

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