细胞复苏的成功与否与冻存及复苏操作息息相关。上周我们讨论了细胞冻存中常见的错误，详细内容见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇将从复苏的角度分析，探讨复苏过程中可能出现的问题。

复苏步骤回顾

在了解复苏常见问题之前，我们先回顾一下复苏步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温，并设置好离心机转速。
2. 准备一个15ml离心管并加入适量的培养基。
3. 取出冻存管，迅速浸入水浴锅中并摇晃，使细胞在2分钟内充分融化。
4. 将细胞悬液缓慢滴入预先添加培养基的离心管中，并以1000rpm离心3分钟。
5. 弃去上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，放入培养箱中。

复苏过程中的常见错误

以下是细胞复苏时可能出现的一些常见错误操作：

1. 运输中的细胞温控不足

如果液氮或冰箱距离水浴锅较远，且在运输中未采取保冷措施，细胞可能在路上开始融化（特别是在夏季）。冻存细胞应放置在干冰或冰盒中运输。

2. 接触冻存管时的误操作

在运输冻存管时，如果用手触碰到细胞部分或将其放在口袋里，会导致局部温度升高，从而引发细胞融化。应当捏住管盖或放在容器中运输。

3. 不当的融化方式

切忌用手捂化（搓热），因为手掌的温度不足以快速且均匀地升温，可能导致细胞因受到热量不均匀和降温速度过慢而死亡。

4. 水浴控制不当

水浴时如未严格控制时间，直接将冻存管静置于水中而不加摇晃，会造成细胞复苏效果差。遵循“快融”的原则，建议在2分钟内完成细胞的充分融化。

5. 结束时管内冰块未完全融化

若水浴结束时冻存管内还有较大冰块，这会影响细胞存活。一方面，冰块中的细胞缓慢升温而死亡；另一方面，冰块会对已融化的细胞造成低温损伤。如果觉得2分钟内难以融化细胞，可以将水浴锅温度调至39℃，适度增加摇晃速度。

6. 忽视DMSO的去除

部分同学在复苏细胞后，会直接用10倍培养基稀释而不离心去除DMSO。这种方式对于贴壁细胞可能有效，但对悬浮细胞却不适用，因此建议始终进行离心操作以去除DMSO，以确保细胞的存活。

以上内容基于小尚多年的经验总结，结合冻存篇，基本涵盖了所有可能导致复苏失败的关键问题。如有其它知识点未提及，欢迎同学们在评论区补充。

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